抑制脂蛋白相关磷脂酶A_2改善载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验研究

【摘要】第一部分慢病毒介导的脂蛋白相关磷脂酶A2RNA干扰抑制RAW264.7细胞炎症基因表达的实验研究研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一个复杂的多因素过程并与炎症密切相关。脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoproteinassociatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)是一个新型的AS危险因子和标志物，并可对斑块不稳定、破裂及未来的心血管事件起到预测作用。Lp-PLA2可以通过水解氧化磷脂并生成具有强大生物学活性的溶血磷脂胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）和氧化非酯化脂肪酸（oxidizednon-esterifiedfattyacid，oxNEFA）,它们都在AS的形成及进展过程中起关键作用。抑制炎症因子及基因治疗是未来治疗AS的新途径。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)可以在临床上高效特异性地降低目标基因的表达。在本研究中，我们采用RNA干扰的方法来降低小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)Lp-PLA2的表达，并通过ELISA和实时荧光定量-聚合酶链反应（realtimepolymerasechainreaction，RT-PCR）检测RAW264.7细胞Lp-PLA2及炎症基因表达变化。目的观察氧化低密度脂蛋白（oxygenizedlowdensitylipoprotein，oxLDL）和Lp-PLA2RNA干扰对RAW264.7细胞Lp-PLA2及炎症基因活性及其mRNA表达的影响。方法我们构建Lp-PLA2RNA干扰慢病毒或者阴性对照慢病毒（negativecontrol，NC），滴度1×109TU(transductionunits)/ml；用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养RAW264.7细胞。RAW264.7细胞经oxLDL预处理后，Lp-PLA2活性及其mRNA表达明显增加。在后续试验中我们采用60μg/mloxLDL对细胞进行预处理因为60μg/ml时oxLDL作用已达平台期。然后我们对RAW264.7细胞转染NC慢病毒或者不同的Lp-PLA2RNAi慢病毒载体(病毒感染复数=50)来确定沉默效率。我们应用ELISA和逆转录-聚合酶链反应检测Lp-PLA2及炎症基因表达的变化。结果1.在oxLDL预处理前RAW264.7细胞Lp-PLA2表达水平极低；oxLDL可明显上调RAW264.7细胞Lp-PLA2活性及其mRNA表达，且其作用呈时间和剂量依赖性。在oxLDL浓度递增至60μg/ml时Lp-PLA2的表达已达平台期。因此在后续实验中我们采用60μg/mloxLDL对RAW264.7细胞进行预处理。2.基因沉默分析显示Lp-PLA2-siteA降低RAW264.7细胞Lp-PLA2表达最有效。3.慢病毒介导的Lp-PLA2RNA干扰可明显抑制oxLDL引起的RAW264.7细胞MCP-l、IL-6及MMP-8表达增高。结论慢病毒介导的Lp-PLA2RNA干扰可明显逆转oxLDL刺激引起的RAW264.7细胞Lp-PLA2及炎症基因高表达。第二部分脂蛋白相关磷脂酶A2RNA干扰抑制载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验研究研究背景尽管目前我们对动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的诸多传统危险因子采取了强化治疗方案，但许多病人依旧不能免于冠脉事件的初发及复发。AS是一个复杂的多因素过程并与炎症有密切联系。AS过程中存在脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoproteinassociatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)过表达。Lp-PLA2可通过水解氧化磷脂生成具有强大生物学活性的溶血磷脂胆碱和氧化非酯化脂肪酸,它们都在AS进展过程中起关键作用。抑制炎症因子及基因治疗是未来治疗AS的新途径。已证实RNA干扰在抑制分裂细胞和非分裂细胞目的基因表达方面非常有效。在本研究中，我们构建载脂蛋白E基因敲除小鼠（apolipoproteinE-deficientmice，apoE-/-小鼠）AS模型，并采用RNA干扰技术来降低Lp-PLA2的表达，然后我们检测了斑块形态学和炎症基因表达的变化并就此过程进行了深入的机制研究。目的验证慢病毒介导的Lp-PLA2RNA干扰是否可以抑制apoE-/-小鼠AS形成。方法86只apoE-/-小鼠均喂养高脂饮食，并在它们的左颈总动脉上放置一个缩窄性硅胶套管来诱导AS斑块形成。我们正中切开小鼠颈部皮肤，小心分离皮下组织，分离颈部肌肉，暴露左颈总动脉，在颈总动脉上放置一个长3mm、内径0.3mm的缩窄性硅胶套管，并用三根丝线固定牢固。apoE-/-小鼠被随机分为Lp-PLA2RNAi组、病毒阴性对照组（NC组）和对照组。然后我们构建Lp-PLA2RNA干扰慢病毒或NC慢病毒载体，8周后对小鼠AS模型进行颈动脉斑块慢病毒转染，对照组应用生理盐水。七周后收集斑块采用HE、油红O和MASSON染色进行病理组织学检查；并采用ELISA和实时荧光定量-聚合酶链反应检测血浆和斑块局部Lp-PLA2及炎症基因表达的变化。结果1.慢病毒转染7周后，与对照组及NC组相比，Lp-PLA2RNAi组血浆Lp-PLA2浓度及斑块局部Lp-PLA2mRNA表达水平均明显降低；且Lp-PLA2RNAi组小鼠斑块局部及全身炎症基因表达水平均明显降低。2.Lp-PLA2RNA干扰也能明显减轻斑块进展，减轻斑块面积，增加纤维帽厚度，并减少斑块脂质含量，增加斑块胶原含量，说明斑块稳定性增加。3.Lp-PLA2RNA干扰对AS的有益作用是独立于降脂作用之外的，因为我们发现Lp-PLA2RNAi组、NC组和对照组组间总胆固醇和甘油三酯水平均无显著性差异。结论我们的研究结果说明慢病毒介导的Lp-PLA2RNA干扰可减轻apoE-/-小鼠动脉粥样硬化并增加斑块的稳定性，且这种有益作用是独立于降脂作用之外的。第三部分脂蛋白相关磷脂酶A2抑制剂及RNA干扰影响载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的对比研究研究背景尽管目前我们对动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的治疗取得了长足进展，但是许多表面健康的AS患者依然会发生猝死，甚至没有任何前驱症状。这促使我们进一步寻找新的动脉粥样硬化危险因子和治疗靶点。脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoproteinassociatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)是一个新型的AS危险因子和标志物，AS过程中存在Lp-PLA2过表达。目前Lp-PLA2的特异性抑制剂darapladib吸引了众多人的关注。以往多项动物实验表明darapladib可以减少斑块内LPC含量，抑制促AS炎症基因表达，并减少斑块坏死核心的形成。然而，在关于darapladib的Ⅱ期大型临床试验中，Lp-PLA2抑制剂darapladib并未改变人类冠状动脉斑块的体积。所以，实验室和流行病学证据关于darapladib对AS的影响仍存在争议。已证实RNA干扰在抑制分裂细胞和非分裂细胞目的基因表达方面非常有效。在本研究中，我们采用两种方法（darapladib和Lp-PLA2RNAi）抑制小鼠Lp-PLA2的表达，并观察Lp-PLA2表达下降对AS及炎症基因表达的影响，探讨治疗动脉粥样硬化的新机制。目的Lp-PLA2在动脉粥样硬化的发病过程起重要作用，特别是在晚期斑块中起重要作用。在本研究中，我们比较了darapladib(一种选择性的Lp-PLA2抑制剂)，与慢病毒介导的Lp-PLA2RNA干扰对载脂蛋白E基因敲除小鼠AS模型的炎症基因表达和动脉粥样硬化的影响。方法96只apoE-/-小鼠均喂养高脂饮食，并在它们的左颈总动脉上放置一个缩窄性硅胶套管来诱导AS斑块形成。我们正中切开小鼠颈部皮肤，小心分离皮下组织，分离颈部肌肉，暴露左颈总动脉，在颈总动脉上放置一个长3mm、内径0.3mm的缩窄性硅胶套管，并用三根丝线固定牢固。apoE-/-小鼠被随机分为对照组、病毒阴性对照组（NC组）、darapladib组和Lp-PLA2RNA干扰（Lp-PLA2RNAi）组。8周后，慢病毒介导的Lp-PLA2RNA干扰或darapladib被用来降低小鼠AS斑块局部Lp-PLA2的表达。5周后收集斑块采用HE、油红O和MASSON染色进行病理组织学检查。我们还在蛋白和mRNA水平检测了AS斑块局部Lp-PLA2及炎症基因表达的变化。结果1.与非处理组小鼠（对照组+NC组）相比，处理组小鼠（darapladib组+Lp-PLA2RNAi）组）血浆促炎因子的表达显著减少，而血浆抗炎因子的表达显著增加。2.此外，我们的研究结果表明处理组小鼠抑制Lp-PLA2表达后，AS斑块内脂质含量显着减少，而胶原含量显著增加。有趣的是，当比较这两种Lp-PLA2的抑制方法后，我们发现，与darapladib组相比，Lp-PLA2RNAi组小鼠斑块面积减少和斑块稳定性的增加更显著。单纯Darapladib治疗不能影响动脉粥样硬化斑块面积。3.抑制Lp-PLA2对AS的有益作用是独立于降脂作用之外的，因为我们发现Lp-PLA2RNAi组、NC组、darapladib组和对照组组间总胆固醇和甘油三酯水平均无显著性差异。结论Lp-PLA2抑制剂darapladib或慢病毒介导的Lp-PLA2RNAi都可减轻载脂蛋白E基因敲除小鼠的炎症基因表达和动脉粥样硬化，且这种治疗作用在Lp-PLA2RNAi组更为显著。
【作者】张辉；
【导师】张金盈；
【作者基本信息】郑州大学，内科学，2014，博士
【关键词】脂蛋白相关磷脂酶A2；动脉粥样硬化；炎症；RNA干扰；小鼠；

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